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半定量RT-PCR的實驗步驟介紹
點擊次數(shù)：914 更新時間：2023-02-10
半定量RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。
實驗步驟：
Trizol法RNA提取步驟
1、提取總RNA
2、逆轉(zhuǎn)錄反應
3、PCR反應
以下實驗步驟僅供參考：
1樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其溶解。
②兩相分離
每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lv仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀
將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積yi丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm
離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗
移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀
溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
