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尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG 酶)操作中的注意事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù):1576 更新時(shí)間:2021-10-19

 尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG 酶)說明書

                                                          

Uracil-N-Glycosylase

Cat. No.   K0951

保存:-20

 

組分說明

 

Cat.No.              K0951      K0951A

 

KitSize               200U      5×200U

 

 Uracil-N-Glycosylase1U/μl        200 μl    5×200 μl

 

產(chǎn)品簡介

 

     尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)也稱為尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶),通過大腸桿菌表達(dá)純化的重組酶,該蛋白分子量為25kD,可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶,并且對RNA無活性,主要應(yīng)用于防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。該酶作用機(jī)理為:在PCR反應(yīng)中以dUTP代替dTTP,擴(kuò)增產(chǎn)物片段中的T全部被U取代,形成了含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNAU堿基的糖苷鍵,降解反應(yīng)體系中含UDNA,有效消除PCR產(chǎn)物的殘留污染,大大降低擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性,從而保證擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性。

 

單位定義

 

     37℃,60分鐘內(nèi)催化1nmol尿嘧啶,從含尿嘧啶的DNA上釋放所需要的酶量定義為一個(gè)單位。

 

質(zhì)量控制

 

     SDS-PAGE檢測純度大于95%;經(jīng)檢測無核酸內(nèi)、外切酶活性。

 

注意事項(xiàng)

 

1. UNG長期儲(chǔ)存(非頻繁使用; 每月少于3)請置于-70℃保存,每天或每周使用請于-20℃保存。盡量避免反復(fù)凍融,大包裝建議分裝使用。

2.UNG可以在PCR反應(yīng)前先清除不慎污染的U-DNA分子,一個(gè)實(shí)驗(yàn)室必須在所有的PCR反應(yīng)中使用dUTP作為dNTP之 一,使所有擴(kuò)增產(chǎn)物都成為U-DNA。如單使用于某個(gè)檢測,T-DNA仍會(huì)積累,此抗污染系統(tǒng)也難以起到*的作用。

3. UNG/dUTP系統(tǒng)是PCR試劑內(nèi)部的一種防污染措施,為了防止PCR產(chǎn)物的污染,尤其是在臨檢實(shí)驗(yàn)室中反復(fù)放大同一片段時(shí),必須嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)室的分劃和操作。  

 

使用方法

 

以下舉例為常規(guī)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。

1.  PCR反應(yīng)體系:

 

試劑                                  50μl反應(yīng)體系               終濃度

TaqPCRBuffer10×            5μl                           1×

dATP10mM                       1μl                        200μM 

 

dGTP10mM                       1μl                        200μM

dCTP10mM                        1μl                         200μM

    

dTTP10mM                        0.5 μl                    100μM

    

dUTP10mM                        1μl                       200μM

    

ForwardPrimer10μM          1μl                      0.2μM

ReversePrimer10μM           1μl                      0.2μM

 

TemplateDNA                         Xμl                  

                                            

TaqDNAPolymerase                 5U/μl                   0.5μl                 

Uracil-N-Glycosylase,         1U/μl                 0.2μl                 

    

RNase-FreeWater                  upto50 μl              

    

 

    注意:TaqDNAPolymeraseUracil-N-Glycosylase的反應(yīng)緩沖液和酶儲(chǔ)存液可以通用。

 

2.  PCR 反應(yīng)條件: 

 

     

步驟               溫度             時(shí)間

    

UNG消化                37-50                  5-10min

預(yù)變性              95℃             10min

變性                94℃             30s

退火               55-65℃           30s         30-40 個(gè)循環(huán)

延伸                          72℃             1min

延伸

    注意:通常將Taq酶與UNG酶按一定的比例加入終PCR反應(yīng)體系中,先于7237-50℃范圍內(nèi)消化 5min5-10分鐘,然后9510分鐘滅活,(同時(shí)這一步也達(dá)到預(yù)變性和熱啟動(dòng)的效果),隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。UNG酶的反應(yīng)可以在37-50℃,5-10分鐘的范圍內(nèi)變化,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要進(jìn)行調(diào)整。

 

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

 


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